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H2N2 流感病毒是 1957 年 “亚洲流感” 大流行的病原体，面前已从流行中覆没。然而，H2 型流感病毒仍在禽类宿主中传播。再加上东谈主类群体中针对 H2N2 的特异性免疫力渐渐舒缓，H2N2 流感病毒存在再次传入东谈主类群体的风险。疫苗有助于铩羽将来的大流行，但要评估其效率则需要动物模子。因此，咱们入部下手彭胀雪狗尾续手脚 H2N2 流感疾病模子的运用，通过鼻内或气管内接种四种不同的 H2N2 病毒来谈判它们对疾病严重进程的影响。这些 H2N2 病毒是在大流行时刻或 H2N2 流行接近尾声时会聚的，涵盖了进化枝 I 和进化枝 II 的病毒。用不同病毒感染雪狗尾续后发现，病毒的复制、疾病推崇和病理特征在不同病毒分离株和感染路线之间存在显耀各别。凭证病毒分离株的不同，鼻内接种会激发从严重到微弱的鼻炎，且不会导致肺部感染或病理变化。当通过气管内接种时，能鄙人呼吸谈收效复制的病毒分离株会激发一种非致命性疾病，访佛于东谈主类的中度肺炎。病毒之间在复制和致病方面的各别可能与其对 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸的结合偏好操办。本文提议的模子可有助于开发新一代的 H2N2 流感疫苗。

伏击性：1957 年，天下遇到了由 H2N2 亚型甲型流感病毒引起的大流行。尽管该病毒在 1968 年覆没了，但 H2 型病毒仍在禽类宿主中传播。因此，H2N2 流感病毒有可能再次传入东谈主类群体，从而激发另一场大流行。通过接种疫苗不错减轻新的 H2N2 流感大流行的影响。然而，这些疫苗起先需要在动物模子中进行开发和测试。为此，咱们彭胀了雪狗尾续模子，以模拟东谈主类感染 H2N2 流感的不同方面和疾病推崇。该模子可用于开发和评估新的 H2N2 流感疫苗。

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一、前言

1957 年，“亚洲流感” 成为 20 世纪的第二次流感大流行。这次大流行的病原体是 H2N2 甲型流感病毒，它是由禽流感的 H2、N2 和 PB1 基因与东谈主类 H1N1 流感病毒基因片断重配产生的。该病毒速即在缺少免疫力的东谈主群中传播，据估量在大流行时刻导致了 100 万至 200 万东谈主升天。自出现后，H2N2 一直手脚季节性流感病毒传播，直到 1968 年被 H3N2 取代。尽管它照旧覆没，但咱们并不成免受其再次传入的恐吓，因为基因相似的毒株仍在鸟类中传播，而且 1968 年以后出身的东谈主不具备 H2 中庸抗体。鉴于 H2N2 曾激发大流行的历史，面前由于东谈主群中针对 H2N2 的体液免疫力正在速即下落，这组成了一种风险。

血凝素（HA）的受体结合域发生的突变会影响其与细胞上受体的结合亲和力。禽源的 HA 卵白更倾向于结合 α2,3 - 团结的唾液酸（SA），而东谈主源稳妥性流感毒株的 HA 则偏好 α2,6-SA（参考文件 10 中有综述）。在从禽类宿主向东谈主类宿主稳妥的过程中，结合偏好从 α2,3-SA 颠簸为 α2,6-SA 可能是禽起源感病毒稳妥的一个要津过程。不及为奇的是，大无数具有禽源 HA 的大流行性甲型流感病毒起程点在东谈主类中传播时，都具有对 α2,3-SA 和 α2,6-SA 的混杂结合偏好（参考文件 11 中有综述）。这些毒株在东谈主类群体中的抓续传播导致它们对 α2,6-SA 的结合偏好渐渐加多。伏击的是，α2,3-SA 主要存在于东谈主类下呼吸谈（LRT）的肺泡细胞上，而抒发 α2,6-SA 的细胞主要存在于上呼吸谈（URT；参考文件 10 中有综述）。上呼吸谈感染时常仅推崇为凡俗伤风症状，而下呼吸谈感染则可能导致严重肺炎。因此，结合亲和力从 α2,3 - 向 α2,6-SA 的颠簸时常伴跟着较低的疾病包袱。因此，各个 H2N2 毒株的结合偏好也可能影响其致病机制。

鉴于下一次 H2N2 大流行的恐吓，需要动物模子来评估 H2N2 疫苗。一般来说，雪狗尾续被以为是谈判流感防护的最好袖珍动物模子，因为它在流感疾病方面与东谈主类相似。这种相似性可能部分归因于 α2,6-SA 的漫衍，雪狗尾续和东谈主类的 α2,6-SA 漫衍相似。其他东谈主照旧标明，雪狗尾续通过鼻内接种 H2N2 流感病毒会被灵验感染，但尚未谈判气管内接种对疾病和病理的影响。通过气管内接种将流感病毒输送到肺部，不错模拟更严重的流感疾病。咱们通过鼻内或气管内接种不同的大流行和季节性东谈主类 H2N2 病毒分离株感染雪狗尾续，发现不同的 H2N2 分离株和感染路线在病毒复制和病理方面存在赫然各别。伏击的是，H2N2 分离株在病毒复制和病理方面的各别可能是由于它们对 α2,3 - 和 α2,6-SA 的结合偏好不同。

二、放置

01.HA 序列与 α2,3 - 或 α2,6 - 唾液酸的结合关系

咱们选拔了两株早期和两株晚期的东谈主类 H2N2 病毒来感染雪狗尾续（图 1A）。新加坡 / 1/57 株（Sin/57）和列宁格勒 / 134/57 株（Len/57）都是在 1957 年大流行时刻分离出来的。加利福尼亚 / 1/66 株（Cal/66）和东京 / 3/67 株（Tok/67）是 H2N2 流行末期的季节性分离株，分别可归类为进化枝 I 和进化枝 II（4）。这些病毒在其 HA 序列上存在微弱的氨基酸各别，这可能会影响它们的结合和复制特点。因此，这些病毒在雪狗尾续模子中可能会激发不同的病理变化。

图1. H2N2 毒株与 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸的结合。（A）东谈主类和禽类 H2 序列的系统发育树。该树是基于 HA 卵白序列通过最大似然法构建的。本谈判中使用的四个东谈主类 H2N2 分离株以粗体线路，GISAID 的 HA 卵白象征符以灰色书写。比例尺暗示遗传距离。（B）本谈判中使用的四个东谈主类 H2N2 流感病毒的 H2 与唾液酸（SA）结合关系的三个位点的氨基酸序列比对（21）。神采凭证 Clustal X 配色决策暗示氨基酸谱的（保守性）。HA 序列凭证 H3 编号线路（42）。（C）H2N2 病毒株与 α2,3 - 和 α2,6-SA 的结合情况，以及（D）通过生物层干与法测定的 α2,6 - 与 α2,3-SA 之间的结合比率。由于列宁格勒株与 α2,6-SA 的结合为零，因此无法细目其比率。数据以平均值 ± 圭臬差暗示，n = 3。使用光棍分方差分析（1-way ANOVA）比较 C 和 D 图中病毒的结合率，然后进行 Tukey 多重比较考试。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001；****，P < 0.0001。ns，无显耀性各别。

HA 对唾液酸的结合偏好主要由 HA 的受体结合口袋决定，该口袋由 130 环、190 螺旋和 220 环组成（21）。咱们对 H2N2 分离株的 HA 片断进行了测序，以谈判它们的结合偏好。Len/57 的 HA 在 220 环（H3 编号；图 1B）中含有谷氨酰胺（Gln）226 和甘氨酸（Gly）228，这与禽源 H2 中发现的残基相对应。具有这些残基的 H2 HA 瞻望既能结合禽源型 α2,3-SA，也能结合东谈主源型 α2,6-SA（21）。比较之下，Sin/57 和 Tok/67 可能更稳妥东谈主类宿主，因为它们含有 Gln226 变为亮氨酸（Leu）和 Gly228 变为丝氨酸（Ser）的替换，已知这些替换会导致对 α2,6-SA 的激烈偏好性结合。固然 Cal/66 与后两株分离株相似，也含有 Ser228，但它在第 226 位是苯丙氨酸（Phe）226，与它们不同。此外，这些病毒的 H2 HA 在 130 环和 190 螺旋上也存在一定进程的各别，这也可能影响受体结合的特异性和 / 或亲和力（图 1B）。

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由于结合偏好会显耀影响病毒的复制，进而影响病理和疾病，咱们入部下手通过生物层干与法来阐明并进一步分析所选病毒的预测结合特点。由于这种结合测定只可在生物安全二级（BSL-2）条款下进行，咱们使用了各自属于生物安全三级（BSL-3）分类的原始病毒的减毒重配疫苗病毒。对疫苗病毒的序列分析标明，与野生型病毒比较，固然出现了一些突变，但这些突变都不存在于 HA 结合口袋中（表 1）。这四种病毒都能与 α2,3-SA 结合（图 1C），尽管它们在运转结合速率上存在一定进程的各别。除了具有禽源样 HA（Gln226/Gly228）的 Len/57 之外，大无数病毒也能与 α2,6-SA 结合（图 1C）。Sin/57 和 Tok/67 优先结合 α2,6-SA，这与它们的东谈主源样 HA 特征（Leu226/Ser228；图 1D）一致。固然 Cal/66（Phe226/Ser228）大略结合 α2,6-SA，但它更倾向于结合 α2,3-SA，就像 Len/57 一样，Len/57 对 α2,6-SA 莫得任何结合。咱们得出论断，不同病毒对唾液酸的结合偏好与基于第 226 和 228 位残基的预测偏好基本相符。真理的是，尽管 Cal/66 病毒是在大流行起程点多年后分离出来的，但它仍然更倾向于结合禽源型受体。需要提防的是，大无数（若是不是全部的话）H2N2 流感病毒分离株在初度分离时起先是在鸡胚上培养的，这可能会在 HA 结合结构域中引入某些突变，以便更灵验地结合 α2,3-SA（22）。这也许不错证明注解为什么相对较晚的大流行株 Cal/66 病毒推崇出对 α2,3-SA 的偏好，尽管这很难考据。

表1. 疫苗株 HA 与相应野生型病毒 HA 的突变情况。a. 本谈判顶用于雪狗尾续感染的 BSL-3 病毒。b. 本谈判顶用于生物层干与法的 BSL-2 病毒。c. 来平稳线存储库的参考株（交流分离株或最密切关系的），用于与野生型病毒的里面 HA 序列放置进行比较。d. 仅可取得 HA 的部分参考序列。

咱们还谈判了本谈判中使用的 H2N2 分离株的 HA 和 NA 卵白序列是否与已知参考序列交流，因为屡次传代可能会引入突变。在 NA 卵白序列中未检测到各别，在 Sin/57、Len/57 和 Cal/66 的 HA 序列中存在一丝氨基酸突变（Len/57 = 1；Cal/66 = 2）（表 1）。这些突变不存在于 HA 的受体结合口袋中，因此不太可能对与唾液酸的结合产生很大影响。对于 Tok/67，咱们发现咱们的病毒分离株与参考序列之间存在多个各别（表 1）。然而，凭证卵白质序列比对（blast），该参考序列与其他（晚期）H2N2 进化枝 II 序列不相似，也莫得聚类在一皆。比较之下，这里报谈的 Tok/67 HA 卵白序列与荷兰 / B2/1968 株有 99.12% 的相似性，何况与其他 H2N2 病毒聚类在一皆（表 1 和图 1A）。因此，很可能是参考序列不正确，而咱们在这里报谈的 Tok/67 序列代表了晚期流行的进化枝 II 病毒，因为它与荷兰 / B2/1968 株有很高的相似性。

02.H2N2 分离株和感染路线之间的病毒复制和组织漫衍存在各别。

接下来，咱们进行了一系列独处的动物实验，用四种 H2N2 病毒感染雪狗尾续，并评估鼻内（i.n.）与气管内（i.t.）接种对病毒复制和病理的影响。咱们起先用 H2N2 分离株 Sin/57 或 Tok/67 感染雪狗尾续，并在感染后第 3、5 和 7 天（dpi）对动物履行安乐死，以细目病毒复制的能源学和病剃头展情况（图 2A）。基于这些实验，咱们发现感染后第 5 天能最好地评估病毒复制和病理情况。因此，随后用 Len/57 和 Cal/66 进行的实验仅在感染后第 5 天评估病理和病毒复制情况。

图2. 病毒组织漫衍和复制能源学取决于感染路线和病毒分离株。（A）4 至 8 个月大的雌性雪狗尾续在第 0 天通过鼻内或气管内接种 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的流感病毒。然后在感染后第 3、5、7 天（Sin/57 和 Tok/67）或仅在第 5 天（Len/57 和 Cal/66）对动物履行安乐死，以谈判病毒复制和病理情况。每个接种路线和剖解日 n = 3。Sin/57 和 Tok/67 的感染在单独的实验中进行，而 Len/57 和 Cal/66 的感染在一个实验中进行。（B，C）通过在 MDCK 细胞上进行 TCID50 测定来测量（B）鼻拭子和咽拭子以及（C）呼吸谈组织中的病毒载量。虚线暗示检测限。数据以（B）平均值 ± 圭臬差或（C）个体值暗示，其中每个点代表一只雪狗尾续。dpi = 感染后天数。“A” 图使用 BioRender 软件创建。

咱们通过测定鼻拭子和咽拭子中的 TCID50 来测量呼吸谈中的病毒复制情况。与之前对于其他 H2N2 流感病毒的报谈访佛（15，17），Sin/57 和 Tok/67 毛糙复制 6 天，因为大无数动物在感染后第 7 天检测为阴性（低于检测限）（图 2B）。鼻内感染 Sin/57 的动物在鼻腔中的病毒滴度赫然高于气管内接种的雪狗尾续，但在咽部未不雅察到这种各别。比较之下，气管内感染 Tok/67 的动物咽拭子中的病毒滴度较低，鼻拭子中的病毒滴度低于检测限。接种路线对 Len/57 和 Cal/66 感染的动物咽拭子中的病毒滴度莫得影响，但鼻内感染 Cal/66 的雪狗尾续从感染后第 3 天起鼻腔中的病毒滴度有所加多。伏击的是，不论是鼻内照旧气管内感染 Len/57 的动物，其鼻拭子中均未检测到有感染性的病毒。总之，除了 Len/57 之外，在咱们谈判的分离株中，鼻内感染的动物鼻腔中的病毒复制水平更高。Len/57 在鼻腔中复制恶果低可能是由于其无法结合 α2,6-SA（图 1C）。除了 Tok/67 病毒外，鼻内和睦管内感染的动物咽部的病毒复制情况十分。

为了更防卫地谈判上呼吸谈（URT）和下呼吸谈（LRT），咱们在感染后第 3、5 和 7 天对鼻腔、气管和肺组织进行匀浆，并通过 TCID50 测定来细目病毒载量。与鼻拭子的放置一致，气管内感染的动物在鼻甲骨中检测到流感病毒的情况大多为阴性（图 2C）。然而，Cal/66 并非如斯，因为在鼻内和睦管内感染的动物的鼻甲骨和睦管中都发现了病毒。对于其他病毒，气管中的病毒复制仅限于鼻内（Sin/57）或气管内（Tok/67）接种的雪狗尾续。Len/57 果然不在职何组织中复制，只须少数动物的病毒载量略高于检测水平。正如预期的那样，仅在气管内感染的动物肺部不雅察到病毒复制，这标明鼻内接种不及以在测试的 H2N2 病毒中拓荒下呼吸谈感染。固然 Sin/57 和 Tok/67 在气管内接种后能在肺部灵验复制，但 Len/57 和 Cal/66 并非如斯。

03.病毒分离株和接种路线之间的发烧和体重减轻情况存在各别。

咱们不雅察到的临床症状时常较轻，只须少数感染 Sin/57 的动物推崇出活动微弱减少和呼吸勤快加剧。感染其他病毒分离株时未不雅察到赫然的临床症状。咱们还测量了发温雅况，因为这是评估疾病严重进程的一个客不雅贪图。一般来说，下呼吸谈感染更为严重（18 - 20），这可能会影响发烧的抓续时刻或热度。Tok/67 和 Sin/57 都能鄙人呼吸谈复制，何况气管内感染导致发烧更早出现（图 3A）。绝顶是在 Sin/57 感染的情况下，气管内感染的动物发烧抓续时刻更长。感染 Cal/66 激发了微弱发烧，但鼻内和睦管内感染的动物之间莫得赫然各别。这与不雅察到的病毒复制局限于上呼吸谈且未能拓荒下呼吸谈感染的情况一致（图 2B）。感染 Len/57 的动物不论感染路线奈何都莫得出现发烧，这也与未拓荒感染的情况相符。

图3. 发烧和体重减轻取决于病毒分离株和感染路线。（A）通过腹部支吾器每隔 30 分钟测量一次体温。数据以与基线的偏差（ΔT）暗示，线条暗示每组的平均值。（B）图 “A” 中感染后 5 天（dpi）内的数据弧线底下积（AUC）。低于基线 2 倍圭臬差以上的体温被摈弃在外，因为这些情况时常是由于麻醉引起的。数据以平均值 ± 圭臬差和个体值（雀斑）暗示。Sin/57 组 n = 8 - 9；Tok/67 组 n = 4；Len/57 组 n = 2；Cal/66 组 n = 2 - 3。（C）感染时刻的体重相对于感染本日的体重。数据以平均值 ± 圭臬差暗示，Sin/57 和 Tok/67 组 n = 3 - 6；Len/57 和 Cal/66 组 n = 3。

弧线底下积（AUC）—— 它是在一定时刻边界内发烧发作总额的繁衍值 —— 证实了对于优先结合 α2,6 的病毒 Sin/57 和 Tok/67，气管内接种会激发更严重的发烧（图 3B）。Cal/66 或 Len/57 则并非如斯。这些发现得到了体重数据的救济。对于 Len/57 和 Cal/66 病毒，鼻内和睦管内感染导致的体重下落情况相似（图 3C）。比较之下，当通过气管内接种时，Tok/67 和 Sin/57 感染导致体重下落更为严重，尽管组内各别相对较大。与 Tok/67 感染比较，Sin/57 感染导致的体重减轻更为赫然。

04.呼吸谈的病理情况受接种路线和病毒分离株的影响。

咱们不雅察到病毒分离株和感染路线影响了病毒复制的部位和临床疾病。为了细目这是否也会导致病理颠倒方面的各别，咱们在感染后第 5 天分析了鼻甲骨和肺组织的苏木精 - 伊红染色切片。鼻甲骨中评分的不同病理参数被汇总为最终的病理严重进程评分，评分边界为 0 - 5 分。正如预期的那样，鼻内接种的雪狗尾续鼻甲骨受到的影响更严重（评分为 1 - 5 分），而气管内感染的动物病理情况不存在或微弱（评分为 0 - 1 分；图 4A 和 B）。鼻内感染导致鼻甲骨和上颌甲骨出现颠倒，而筛骨（感觉）甲骨在很猛进程上未受影响。在感染后第 5 天，鼻内接种 Sin/57 的雪狗尾续出现严重鼻炎，伴有杯状细胞魁梧、假复层鳞状上皮以及严重的（黏膜下）炎症。笼统起来，病理评分为 5 分。Tok/67 感染较轻，推崇为轻度至中度鼻炎和黏膜下微弱炎症。呼吸谈上皮在较大面积上受到中度影响，出现魁梧和纤毛缺失，最高评分为 3 分。鼻内感染 Cal/66 的雪狗尾续评分为 2 - 3 分，呼吸谈上皮名义出现颠倒，从黏膜的微弱烦嚣到上皮衬里的假零散不等。黏膜下存在炎症和充血。与其他三种病毒不同，Len/57 在雪狗尾续中不会引起太多病理变化。仅不雅察到（黏膜下）黏膜的微弱烦嚣和炎症，在鼻内和睦管内感染 Len/57 的雪狗尾续中最高评分为 1 分。

图4. 呼吸谈的病理情况由病毒分离株和接种路线决定。（A）不同病理严重进程的代表性鼻甲骨切片的苏木精 - 伊红染色，放大倍数为 ×100。比例尺暗示 50μm。（B）感染后 5 天（dpi）鼻甲骨的病理回来评分（评分边界 0 - 5 分）。（C）不同病理严重进程的代表性肺切片的苏木精 - 伊红染色，放大倍数为 ×50。比例尺暗示 200μm。（D）感染后 5 天（dpi）肺不同节段的毁伤和炎症参数的病理评分（评分边界 0 - 5 分）。（E）D 图中评分的受病理影响的肺组织百分比。（F）感染后的肺分量相对于感染本日的体重。数据以个体值（A，C - E）暗示，平均值 ± 圭臬差（仅 D 和 E）。整个图 n = 3，E 图中 Sin/57 组之外（n = 2 - 3）。

在肺部，感染激发了轻度至中度的多灶性支气管间质性肺炎，其严重进程取决于感染路线和病毒分离株。在各个组中不雅察到的主要病理特征是临了细支气管和呼吸性细支气管周围的多灶性炎症（细支气管周围炎），评分边界为 0 - 5 分中的 0 - 3 分（图 4C）。炎症包括淋巴细胞、巨噬细胞和多形核细胞。在某些情况下，细支气管管腔内充满了单核细胞和多形核细胞浸润以及一些坏死的细胞碎屑，但并未阻碍。细支气管上皮衬里的烦嚣仅限于轻度至中度的魁梧和增生。偶尔会不雅察到细支气管上皮坏死、间质炎症和肺泡间隔充血。恐怕会出现肺泡炎、肺泡出血和血管周围炎。支气管中偶尔会出现颠倒，而支气管本人未受影响。

对多个肺节段的毁伤和炎症关系病理参数进行评分，评分边界为 0 - 5 分。感染路线和病毒之间的各别在细支气管的毁伤和炎症方面最为赫然（图 4D）。正如预期的那样，气管内接种后肺部病理情况更为严重，尤其是 Sin/57 和 Tok/67 的情况。在感染Len/57 和 Cal/66 的动物的支气管和细支气管中果然未检测到颠倒，这反应了这些病毒鄙人呼吸谈中莫得临床疾病和病毒复制。对于除 Len/57 之外的整个病毒分离株，咱们不雅察到一种趋势，即气管内接种导致受影响的肺组织百分比更高（图 4E）。咱们还测定了 H2N2 感染后肺分量与体重的相对比值，手脚对组织炎症和水肿酿成的客不雅分析。相对肺分量的加多证实，与鼻内接种比较，气管内感染会导致更严重的下呼吸谈病理变化（图 4F）。正如预期的那样，Len/57 并非如斯，因为它鄙人呼吸谈中不复制。

三、商议

在此，咱们答复了为评估疫苗而彭胀雪狗尾续手脚 H2N2 流感感染和疾病模子的关系谈判职责。在咱们谈判的四种病毒中，感染两株均优先结合 α2,6 - 唾液酸的病毒（Sin/57 和 Tok/67）会导致抓续的高病毒复制水温情疾病症状。比较之下，Cal/66 的复制局限于上呼吸谈，仅激发微弱疾病。Len/57 感染果然不激发疾病，这反应出未拓荒起灵验的感染。Sin/57 和 Tok/67 的复制部位赫然由接种路线决定，因为千里积鄙人呼吸谈的病毒不会感染上呼吸谈，反之也是。这与 Cal/66 不同，对于 Cal/66，不论是上呼吸谈照旧下呼吸谈接种，都仅导致其在上呼吸谈复制。因此，对于两株病毒，复制部位由接种路线决定，而对于另一株病毒，其结合偏好可能将复制限度在了上呼吸谈。复制部位也影响了疾病的严重进程，因为与鼻内接种比较，通过气管内接种导致的下呼吸谈感染会激发更严重的临床疾病和病理变化。

在咱们测试的四种 H2N2 病毒中，整个对雪狗尾续的感染都未导致升天，这与其他（季节性）东谈主类 H1N1 和 H3N2 病毒的情况访佛。比较之下，感染禽源的 H5N1 和 H7N9 分离株（取决于毒株和接种路线）会导致雪狗尾续升天。在这个 H2N2 流感雪狗尾续模子中未出现升天情况，这反应了 H2N2 大流行时刻东谈主类的情况，与 1918 年大流行或 H5N1 和 H7N9 的东谈主畜共患感染比较，H2N2 大流行并非极其致命。早期答复标明，大流行性 H2N2 疾病的临床症状与凡俗季节性流感莫得太大各别。最伏击的是，大无数 H2N2 大流行导致的升天发生在相称年幼、相称大哥或患有归拢症的东谈主群中。因此，对 H2N2 感染最准确的模拟应该推崇为一种微弱的、非致命性的疾病。从这个角度来看，用 H2N2 病毒对雪狗尾续进行鼻内和睦管内接种都能准确模拟东谈主类的 H2N2 感染。

很难将 H2N2 流感雪狗尾续模子中的病理情况与东谈主类病例进行比较，因为病理答复仅记载了致命的 H2N2 病例。然而，基于这些答复咱们发现，雪狗尾续的病理特征与东谈主类病例相似，尽管进程较轻。在东谈主类和雪狗尾续中，H2N2 感染都可能导致多灶性肺炎。雪狗尾续会出现充血景色，但在东谈主类中似乎更为严重。细支气管的上皮衬里在东谈主类和雪狗尾续中都会受损，不外对于雪狗尾续而言，受损迹象仅限于魁梧和增生。严重充血、肺泡出血和毛细血管血栓酿成是致命感染的标记，且仅在东谈主类病例中不雅察到。雪狗尾续的（病理严重进程）赫然受到接种路线的影响。一般来说，鼻内接种激发的微弱疾病代表了典型的季节性感染，而气管内接种则激发中度肺炎。这主要体面前 Sin/57 和 Tok/67 这两株病毒上，它们在上呼吸谈和下呼吸谈都能灵验复制。Cal/66 也有访佛的病理情况，但进程较轻。比较之下，Len/57 鄙人呼吸谈的复制水平低于检测限，与鼻内接种的情况访佛；气管内接种不会激发疾病或病理变化。

咱们和其他谈判小组之前都曾用 H2 流感病毒感染过雪狗尾续。在之前的一项谈判中，咱们仅通过鼻内路线用 Cal/66 或 Tok/67 感染雪狗尾续。对于这两株病毒，雪狗尾续在咽部和鼻甲骨中都推崇出较强的病毒复制武艺。尽管在这项谈判中，感染 Cal/66 似乎比感染 Tok/67 激发的发烧稍许严重一些，但感染病毒的雪狗尾续鼻甲骨的病理评分在不同病毒分离株之间相似，且与咱们在此答复的放置十分。谈判东谈主员们通过鼻内接种雪狗尾续，发现所谈判的整个病毒不论鼻内接种与否，都能在鼻甲骨和肺部复制。这不太可能是由于接种体积的各别导致的，但更高的感染剂量可能起到了一定作用。固然谈判东谈主员们使用的感染剂量比咱们高（10⁷半数组织培养感染剂量（TCID50）对比咱们的 10⁶ TCID50），但他们的接种体积更小（0.2 mL 对比咱们的 0.5 mL）。不异，谈判东谈主员们照旧标明，以 0.5 mL 的体积用 10⁶ TCID50 的 H1N1 或 H3N2 流感病毒进行鼻内接种足以将病毒引入肺部。或者，谈判东谈主员们测试的病毒分离株可能具有不同的唾液酸结合偏好，又或者这些病毒受接种路线的限度较小。谈判东谈主员们标明，偏好 α2,3 - 唾液酸的 H2N2 病毒在雪狗尾续中的传播恶果较低。对于其中一株病毒，在感染的雪狗尾续中当然发生了谷氨酰胺（Gln）226 变为亮氨酸（Leu）的替换。这种突变与对 α2,6 - 唾液酸的结合亲和力增强操办，并显耀擢升了病毒在雪狗尾续之间的传播恶果。这很可能是由于 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸在雪狗尾续呼吸谈中的漫衍情况凯旋导致的，在雪狗尾续呼吸谈中，α2,6 - 唾液酸在通盘呼吸谈中抒发更为丰富。这些谈判以及咱们的结合分析放置，在一定进程上证明注解了为什么结合 α2,3 - 唾液酸的 Len/57 在雪狗尾续中果然不复制，也不会引起可不雅察到的疾病和病理变化。不异，偏好 α2,6 - 唾液酸的 Sin/57 和 Tok/67 大略松弛感染雪狗尾续的呼吸谈，导致高病毒滴度和随之而来的病理变化。Cal/66 偏好 α2,3 - 唾液酸，但也仍然大略结合 α2,6 - 唾液酸。尽管如斯，与偏好 α2,6 - 唾液酸的病毒比较，Cal/66 在肺部的复制水平大大裁减。有可能是 Cal/66 照旧稳妥了在上呼吸谈较低温度下的复制，这限度了它在温度较高的下呼吸谈中的复制。需要更多的谈判来论说这种复制各别的分子基础。

病毒复制、疾病和组织病理学因接种路线和病毒的不同而有所各别。赫然，由于 Len/57 缺少灵验的病毒复制和疾病推崇，不适调解为雪狗尾续 H2N2 疾病的模子。比较之下，Cal/66 如实大略复制并激发微弱疾病，尽管它无法感染下呼吸谈。对于将来的雪狗尾续模子，咱们更倾向于使用 Sin/57 或 Tok/67。这两株病毒都能在上呼吸谈和下呼吸谈复制，且受接种路线的限度，这可用于调整疾病的严重进程。气管内接种激发的下呼吸谈感染通常比鼻内接种激发的上呼吸谈感染更为严重。在咱们看来，因此对于评估疾病严重进程的疫苗攻毒模子，气管内接种更为合适，而鼻内接种则更适合评估疫苗指令的免疫对减少病毒传播的作用。

通过本文所呈现的谈判，咱们标明雪狗尾续是模拟东谈主类 H2N2 流感的一个具有代表性的模子。感染路线和毒株的选拔不错篡改所激发的疾病严重进程和病理情况，使咱们大略模拟轻度和中度的 H2N2 疾病。再结合谈判雪狗尾续细胞免疫和体液免疫的器具及试剂的开发，咱们面前领有了一个可行的模子，用于在铩羽流感感染的布景下谈判疫苗指令的免疫反应。这些进展大略进一步鼓动对新式、转换流感疫苗的谈判。

四、材料与步伐

01. 伦理声明

整个动物实验均已取得普纳瓦拉科学园动物谈判中心动物福利机构的批准，批准许可编号为荷兰中央动物实验委员会的 AVD3260020184765。整个实验门径均依据欧盟律例开展。每天搜检动物的总体健康景象，感染后每天对雪狗尾续的活动情况和呼吸阻挠进程进行评分。活动情况摄取以下评分系统：0 = 活跃；1 = 受到刺激时活跃；2 = 不活跃；3 = 嗜睡；呼吸困顿情况评分：0 = 呼吸普通；1 = 呼吸匆忙；2 = 呼吸千里重且为腹式呼吸。若是动物在预定实当前刻之前，凭证章程的极端圭臬（嗜睡或呼吸千里重、不活跃或体重减轻卓著 20%）推崇出严重疾病症状，将在使用氯胺酮（5 毫克 / 千克）和右好意思托咪定（0.1 毫克 / 千克）麻醉的情况下，通过腹黑放血履行安乐死。

02. 病毒

从流感毒株储存库中获取了在鸡胚中培养的野生型 H2N2 流感病毒（包括四株病毒），其传代历史未知。减毒活 H2N2 病毒，某重配病毒。整个触及野生型 H2N2 病毒的实验均在生物安全三级（BSL-3）条款下进行。流感病毒在添加了 40 微克 / 毫升庆大霉素、0.01M 甘油磷酸胆碱和 2 微克 / 毫升经 TPCK 科罚的胰卵白酶的 MEM 培养基中的 MDCK 细胞上进行培养。当细胞病变效应（CPE）卓著 90% 时，会聚细胞悬液并离心（4000×g，10 分钟）以去除细胞碎屑，然后储存在–80°C 环境中。减毒重配病毒的 HA 序列进行测序，序列已存入环球流感序列数据库（GISAID）（象征符见表 1）。

03. 病毒测序与比对

使用特定引物通过团聚酶链式反应（PCR）扩增 H2N2 流感病毒的 HA 和 NA 片断。使用某测序仪进行测序，序列数据使用里面经过进行分析。从环球流感序列数据库（GISAID）和基因库（GenBank）中索要野生型东谈主类和禽类流感病毒分离株的 HA 序列（象征符见图 1A）。使用 MEGA11 软件通过 MUSCLE 算法对野生型和重配的 H2N2 病毒序列进行比对。使用某软件凭证 Clustal X 配色决策对已比对的野生型东谈主类 H2N2 病毒进行神采编码。这些 HA 序列凭证 H3 编号线路。使用禽类和东谈主类野生型 H2N2 病毒的 HA 卵白序列在 MEGA11 软件中构建最大似然系统发育树。对于系统发育树中面容的整个病毒，除了两株病毒（其莫得好意思满的 HA 序列存入数据库）外，HA 卵白序列均来自环球流感序列数据库（GISAID），本文中使用的是这两株病毒报谈的全长 HA 序列。

04. 动物科罚

提供的 4 至 8 个月大的雌性雪狗尾续，需检测其先前是否感染过流感和阿留申病，仅选拔检测放置为阴性的动物。雪狗尾续到达动物设施后，凭证体重进行分组，并以组为单元饲养在怒放式笼子中。从感染那一刻起，整个操作均在经过 BSL-3 认证的休止器中进行。在实验起程点前 14 天，将 “DST micro T” 温度支吾器（冰岛加尔扎拜尔的 Star-Oddi 公司）植入雪狗尾续腹部，以测量体温。进行此操作时，使用氯胺酮（5 毫克 / 千克）和右好意思托咪定（0.1 毫克 / 千克）对动物进行麻醉。术后使用某药物（0.2 毫升）手脚止痛药。使用阿替好意思唑（0.25 毫克 / 千克）拮抗右好意思托咪定的麻醉作用。采血和感染操作使用交流的麻醉剂，但对于感染操作，阿替好意思唑的使用蔓延 30 分钟，以幸免因打喷嚏和咳嗽而排出接种物。在莫得其他科罚（如感染 / 采血）的日子里，仅使用氯胺酮麻醉雪狗尾续后进行体重测定和拭子采集。雪狗尾续可摆脱进食和饮水。在预定实本质验时，使用氯胺酮和右好意思托咪定麻醉雪狗尾续，然后通过腹黑放血进行安乐死。

05. 谈判联想

此处呈现的数据来自三个独处的雪狗尾续实验（1 = 某株病毒；2 = 某株病毒；3 = 某两株病毒）。在每个实验中，雪狗尾续通过鼻内（0.5 毫升）或气管内（3 毫升）接种 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的四种选用 H2N2 流感病毒中的一种。在感染某两株病毒后的第 3 天、第 5 天和第 7 天，正法动物以谈判病理和病毒学情况。对于感染某两株病毒的实验，仅在感染后第 5 天将动物安乐死。每个条款（感染路线和实验实现日）下的组均包含三只动物。

在感染后的第 2 天、第 3 天和第 5 天，采集鼻拭子和咽拭子并测量体重。对于感染某两株病毒的情况，在感染后的第 1 天、第 4 天、第 6 天和第 7 天非凡采集拭子并测量体重。鼻拭子和咽拭子采集到含有 15% 蔗糖、2.5 微克 / 毫升两性霉素 B、100 单元 / 毫升青霉素、100 微克 / 毫升链霉素和 250 微克 / 毫升庆大霉素的 2 毫升运输培养基中，并储存在–80°C 环境中。在预定的时刻点，按照之前描绘的步伐对动物进行剖解。简而言之，使用（氯胺酮和右好意思托咪定）麻醉动物并使其放血，然后夹住气管，分离充气的肺部，称重并搜检大体病理情况。分离气管中段（约 1 厘米）、右肺三个肺叶和副叶沿近端到远端轴的切片（约 1 厘米 ×3 毫米）以及右侧鼻甲骨，并储存在裂解基质 A 管中，于–80°C 保存，以便后续进行病毒学分析。将左肺头叶和尾叶以及左侧鼻甲骨固定在 10% 缓冲福尔马林顶用于组织病理学分析。

06. 动物体温、体重和肺分量

从植入的温度记载仪中获取温度数据，数据为每 30 分钟测量一次的放置。基线温度诡计为感染前 4 天的平均温度。温度变化诡计为与基线的偏差（ΔT）。弧线底下积（AUC）诡计为直到感染后第 5 天的总 ΔT。小于 “基线–基线圭臬差的 2 倍” 的值被摈弃，因为这些值时常是由麻醉引起的。相对体重和相对肺分量暗示为感染本日体重的百分比或比例。

07. 病毒定量

将解冻的肺、气管和鼻甲骨样本在裂解基质 A 管中使用 FastPrep进行匀浆，然后以 4000×g 离心 5 分钟进行表示科罚。将鼻拭子和咽拭子解冻并涡旋回荡。整个用于病毒定量的样本进行连气儿稀释，并在感染培养基（MEM + 40 微克 / 毫升庆大霉素、0.01M 甘油磷酸胆碱和 2 微克 / 毫升经 TPCK 科罚的胰卵白酶）中的 MDCK 细胞上进行六次相通测试。培养 6 天后对细胞病变效应（CPE）进行评分，并使用 Reed–Muench 步伐诡计半数组织培养感染剂量（TCID50）值。

08. 病理

按照之前描绘的步伐进行病理评分。简而言之，将左肺头叶和尾叶用 10% 甲醛充气并储存。固定后，将肺叶包埋在石蜡中并切成 5 微米厚的切片。切片用苏木精和伊红染色，并在 ×50 或 ×100 放大倍数下进行显微镜搜检。对于每个肺叶，至少对 6 个显微镜视线进行评分。病理评分诀别 “上皮毁伤” 和 “炎症” 类别。与毁伤关系的参数包括魁梧、增生、扁平或假复层鳞状上皮、支气管（细支气管）上皮坏死和剥脱、隔阂充血以及肺泡气肿和出血。与炎症关系的参数包括（细）支气管炎、间质浸润、肺泡炎以及以多形核（PMN）细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的（血管周围）血管炎。病理放置按 0（无颠倒）到 5（严重毁伤）的品级进行评分，并汇总为 “上皮毁伤” 和 “炎症” 两个类别的 “最终评分”。在 ×20 放大倍数下估量受影响肺组织的百分比。

鼻甲骨的固定和染色步伐与肺组织访佛，并按照之前报谈的步伐进行分析。对切片进行显微镜搜检，并凭证不同组织病理学参数对组织的影响严重进程和百分比细目一个回来评分（边界为 0–5）。组织病理学参数包括上皮衬里的毁伤、炎性细胞的存在以及渗出物和 / 或出血的存在。整个显微镜切片进行速即成列并盲法评分。

09. 受体结合

使用 Octet RED348通过生物层干与法分析 H2N2 病毒的结合活性，步伐与之前描绘的访佛。简而言之，将链霉亲和素传感器用生物素化的合成聚糖 2,3 - 唾液酸基 - N - 乙酰乳糖胺 - N - 乙酰乳糖胺（3’SLNLN，称为 α2,3 - 唾液酸）或 2,6 - 唾液酸基 - N - 乙酰乳糖胺 - N - 乙酰乳糖胺（6’SLNLN，称为 α2,6 - 唾液酸）饱胀加载。合成聚糖由荷兰乌得勒支大学化学生物学与药物发现系合成。随后，在存在 NA 扼制剂奥司他韦羧酸盐（OC）的情况下，将传感器移至含有病毒的孔中 15–30 分钟，以取得病毒结合弧线，如之前所述，该弧线用于细目病毒运转结合速率（指 vobs = dB/dT，单元为纳米 / 分钟）。整个实验均在含有钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于 30°C 下进行，传感器以 1000 转 / 分钟的速率回荡。运转结合速率凭证病毒颗粒数目进行归一化科罚，病毒颗粒数目通过使用 NanoSight NS300 仪器进行纳米颗粒追踪分析来细目，步伐如之前所述。病毒制剂用超纯磷酸盐缓冲液（PBS）预稀释，以达到适合用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行分析的浓度。整个测量均在 19°C 下进行。NanoSight NS300 每次分析记载五个 60 秒的样本视频，然后使用纳米颗粒追踪分析 3.0 软件进行分析，生成对于颗粒数目的定量信息。颗粒数目用于细目每个颗粒的运转结合速率。

10. 数据分析、统计考试和数据可用性

使用 R 软件（v4.0.2）以及 tidyverse、ggpubr 和 ggplot2 等软件包进行数据分析和可视化。为便于可视化，对病毒滴度进行以 10 为底的对数颐养。使用光棍分方差分析（1-way ANOVA）比较唾液酸结合数据，然后在 GraphPad Prism 软件（v9.1.0）中进行 Tukey 多重比较考试。由于雪狗尾续实验的每组数目（n = 3）不及以进行可靠的统计考试，因此未进行统计考试。一些数据被摈弃在分析之外，包括在章程的实当前刻点之前出现故障并关闭的温度支吾器数据。在感染后第 3 天，未测量一只感染某株病毒的雪狗尾续的肺分量。莫得其他数据被摈弃在分析之外。病毒 HA 序列可从环球流感序列数据库（GISAID）获取，象征符见表 1 和图 1。救济主要图表的数据可应通信作家的要求提供。

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